摘 要：目的：探讨环状RNA(circRNA)＿0031269在宫颈癌组织及宫颈癌细胞中的表达水平。方法：选取2017年1月至2019年12月深圳市前海蛇口自贸区医院妇科收治的40例宫颈癌切除术后患者的肿瘤组织标本及相应的癌旁组织标本为研究对象。采用实时荧光定量（RT-qPCR）检测circRNA＿0031269在宫颈癌组织和癌旁组织中的表达水平，以及在宫颈癌细胞Siha及Hela中的表达水平。结果：circRNA＿0031269在宫颈癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织（P<0.05）;circRNA＿0031269在宫颈癌细胞Siha及Hela中的表达水平明显高于人永生化表皮细胞HaCaT(P<0.05)。结论：circRNA＿0031269在宫颈癌组织和宫颈癌细胞（Siha、Hela）中的表达水平明显升高。
关键词: circRNA_ 0031269; 宫颈癌; Siha细胞; Hela细胞;
宫颈癌是最常见的妇科肿瘤之一，严重威胁女性健康。近年来，虽然宫颈癌的诊断和治疗技术取得了很大的进步，但宫颈癌的发病率及死亡率仍很高，特别是对于晚期宫颈癌患者，目前所有的治疗方法效果均欠佳[1]。因此，研究宫颈癌细胞增殖、迁移侵袭的机制并寻找新的治疗靶点，对提高临床诊断及治疗具有十分重要的意义。环状RNA(circular RNA,circ RNA）是一种具有共价闭环结构的小分子非编码RNA，广泛分布于细胞内。近10年来，已有大量的研究结果证实，circ RNA在肿瘤发生、发展的过程中具有重要的生物学作用[2]。然而，circ RNA调控宫颈癌发生发展的具体分子机制尚未完全阐明。本研究通过检测circ RNA＿0031269在宫颈癌组织及宫颈癌细胞中的表达情况，探讨其在宫颈癌发生发展中的作用，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2017年1月至2019年12月深圳市前海蛇口自贸区医院妇科收治的40例宫颈癌切除术后患者的肿瘤组织标本及相应的癌旁组织标本为研究对象。本研究经深圳市前海蛇口自贸区医院伦理委员会审核，并且批准实施，所有病历资料征得患者同意，并已签署知情同意书。
纳入标准：(1)经病理组织学确诊为宫颈癌。(2)所有宫颈癌患者均无放疗或化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗史。(3)术后随访资料完整。
排除标准：(1)存在其他妇科疾病。(2)术前进行过放疗或服用过抗肿瘤药。(3)兼具其他脏器的肿瘤患者。
1.2 主要试剂和仪器
宫颈癌细胞系（Siha、Hela）和人永生化表皮细胞Ha Ca T购自美国ATCC（马纳萨斯，美国）；TRIzol试剂购自Invitrogen公司（美国）；反转录、实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒购自Ta Ka Ra公司（日本）；RPMI 1640培养基、DMEM培养基、FBS试剂购自Gibco公司（美国）；Nano Drop ND-2000分光光度计购自Life Technologies公司（美国）；Light-Cycler-480 RT-PCR仪购自Roche公司（瑞士）。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养及传代
宫颈癌细胞Siha、Hela均使用含10%FBS的DMEM培养基培养，所有细胞均在37℃、5%CO2的培养箱环境中培养。当培养皿中细胞生长密度为70%～80%时，即对细胞传代。
1.3.2 总RNA提取和RT-q PCR
按照说明书，使用TRIzol试剂从组织及对数生长的细胞系中分别提取总RNA；利用分光光度计测量提取的组织及细胞的RNA纯度；将纯度合格的总RNA 500 ng进行反转录，并合成最后体积为10μL的c DNA。应用的反转录体系为：2μL 5×Buffer,0.5μL RT Enzyme MixⅠ，0.5μL Oligo d T引物、随机引物（100μmol/L），总RNA 500 ng，去离子水加至10μL。反应条件为：37℃，15 min,85℃5 s,4℃，+∞。应用的PCR反应条件：95℃30 s后，95℃5 s和60℃20 s，进行40个循环。引物序列见表1。所得数据通过公式2-ΔΔCt进行计算分析，内参采用GAPDH进行标准量化。
表1 引物序列
1.4 统计学方法
采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
应用实时荧光定量（RT-q PCR）技术检测circ RNA＿0031269在40例宫颈癌组织与癌旁组织，宫颈癌细胞Siha、Hela与人永生化表皮细胞Ha Ca T中的表达情况，结果表明，circ RNA＿0031269在宫颈癌组织中的表达量明显高于癌旁组织（P<0.05），见图1;circ RNA＿0031269在宫颈癌细胞Hela、Siha中的表达量明显高于人永生化表皮细胞Ha Ca T(P<0.05），见图2。
图1 circ RNA＿0031269在癌旁组织及宫颈癌组织中的相对表达量
注：1)P<0.05。
图2 circ RNA＿0031269在Ha Ca T、Hela、Siha细胞中的相对表达量
注：1)P<0.05。
3 讨论
circ RNA与micro RNA、lnc RNA同属于非编码RNA，与micro RNA、lnc RNA不同，circ RNA稳定存在于真核生物细胞中，具有多种生物学作用，包括调控基因转录、micro RNA海绵吸附作用，甚至有翻译蛋白质功能[3]。目前，研究发现，circ RNA对包括宫颈癌在内的多种肿瘤的增殖、侵袭和转移具有重要作用[4]。
circ RNA在许多类型的癌症中高表达，如乳腺癌、肺癌和大肠癌[5,6,7]。几种circ RNA在子宫颈癌组织以及衍生的细胞系中异常表达，并且主要通过吸附micro RNA来促进肿瘤发生。有研究报道，由Clorf116基因编码的hsa＿circ＿0141539(circ RNA-000284）被发现在子宫颈癌组织中的表达明显高于邻近的非肿瘤组织，并且与肿瘤的大小、FIGO分期以及子宫肌层浸润直接相关[8,9,10]。hsa＿circ＿0141539能够使mi R-518d-5p/519-5p海绵化，从而导致靶基因CBX8的表达增加，并促进子宫颈细胞的恶性转化。此外，hsa＿circ＿0023404和VEGFA在宫颈肿瘤中被一致上调，而mi R-5047表达不足。
circ RNA＿0031269位于chr14:23495059-23504429，其基因长度为9 370个碱基。目前，尚无关于circ RNA＿0031269与宫颈癌关系的报道。本研究明确了circ RNA＿0031269在宫颈癌组织中的表达量明显高于癌旁组织（P<0.05),circ RNA＿0031269在宫颈癌细胞Siha、Hela中的表达量明显高于人永生化表皮细胞Ha Ca T(P<0.05）。
目前，我们对circ RNA调控宫颈癌发生发展的作用机制的了解仍然很有限。现阶段大部分研究主要局限于circ RNA的micro RNA海绵吸附作用及其对下游靶基因的调节作用。对于circ RNA的其他功能，如circ RNA与RNA结合蛋白（RBP）的相互作用、circ RNA的蛋白质翻译功能、circ RNA的功能组学等方面研究较少，这些研究可为探索circ RNA调控肿瘤生物学功能提供更多思路，本研究仍需进一步探索circ RNA＿0031269影响肿瘤发生发展的机制，随着研究的不断深入，circ RNA＿0031269调控宫颈癌发生发展的分子机制将会被阐明。
参考文献
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文章名称：circRNA＿0031269在宫颈癌组织及宫颈癌细胞中的表达水平
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