14次 摘要：为探究PPAR与c/EBP基因在苏太猪不同组织中的表达与脂肪沉积的关系,本实验以10月龄苏太猪为研究对象,运用实时荧光定量PCR (q RT-PCR)技术检测PPAR与c/EBP基因mRNA在苏太猪心、肝、脾、肺、肾、胃、背最长肌和皮下脂肪8个组织中的表达水平。结果表明,PPA --> 摘要：为探究PPARγ与c/EBPα基因在苏太猪不同组织中的表达与脂肪沉积的关系,本实验以10月龄苏太猪为研究对象,运用实时荧光定量PCR (q RT-PCR)技术检测PPARγ与c/EBPα基因mRNA在苏太猪心、肝、脾、肺、肾、胃、背最长肌和皮下脂肪8个组织中的表达水平。结果表明,PPARγ与c/EBPα基因在苏太猪的8个组织中均有不同程度的表达,其中,PPARγ基因在苏太猪脾脏组织中的表达量最高,皮下脂肪中的表达水平仅次于脾;以背最长肌中PPARγ基因的相对表达量作对比,背最长肌与脾、肺和皮下脂肪的相对表达差异极显著(p<0.01),其余为差异不显著(p>0.05),表达量高低顺序为脾>皮下脂肪>肺>心>胃>肾>肝>背最长肌;c/EBPα基因在苏太猪的皮下脂肪的表达量最高,以背最长肌中c/EBPα基因的相对表达量作对比,在肝、脾、皮下脂肪组织中表达差异极显著(p<0.01),肺的相对表达差异显著(p<0.05),其余组织中差异不显著(p>0.05),表达量的高低顺序为皮下脂肪>肝>脾>肺>肾>心>胃>背最长肌。两基因在各组织中表达趋势趋于一致。试验结果表明PPARγ和c/EBPα基因可能对猪脂肪沉积有重要影响。 关键词：苏太猪; PPARγ; c/EBPα; RT-PCR; 表达量; 苏太猪是以中国太湖猪为基础母本与杜洛克经过多年的杂交选育而来，属于瘦肉型猪种(华金弟等,2003)，既有太湖猪的高繁殖性能，又有杜洛克、长白猪和大白猪瘦肉率高的优点(徐朵燕,2012)。本试验以脂肪沉积相关基因PPARγ与c/EBPα为候选基因，研究苏太猪不同组织中PPARγ与c/EBPα基因mRNA的表达水平。近年来的研究表明脂肪沉积对肉品质的影响突出，而肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量是影响肉品质的主要因素，与肉的风味、嫩度、营养价值等肉质性能相关(王怡平等,2017)，且IMF的含量与肉质性状表现为正相关(宋代军,2014)，因此，探究PPARγ与c/EBPα基因在苏太猪中不同组织的表达规律，对苏太猪肉质性状的研究具有重要意义。 过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)具有调节脂肪形成、糖脂代谢和细胞增殖分化等生物学功能(White and Stephens,2010)。PPARγ是核内受体转录因子超家族成员之一，核内受体转录因子超家族成员(PPARs)包括α、β和γ3种亚型，各自由不同的基因编码，PPARs能促进脂质的合成，在许多组织中均有表达(Yan et al.,2015)，而在这几个亚型中PPARγ在脂肪代谢过程中作用更明显(林婄婄等,2012)。研究证明PPARγ在脂肪细胞分化中起重要作用，是脂肪组织生长发育的主要调控及转录因子，其信号通路可直接影响脂质代谢(Tontonoz et al.,1994)。Adams等(1997)研究发现PPARγ的表达量与脂肪生成在早期呈正相关变化。高霞等(2017)通过诱导猪DFAI细胞成脂再分化并检测过程中PPARγ的表达，经研究发现随着诱导时间增加，脂滴数量增多，体积增大，PPPARγmRNA的表达量也随着诱导时间的增加而上升。CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,c/EBPα)是碱性亮氨酸拉链蛋白家族的一员，碱性亮氨酸拉链蛋白家族是一类在前脂肪细胞分化过程中起关键作用的转录因子之一(于莎莉等,2011)，它有6种同分异构体，分别为c/EBPα、c/EBPβ、C/EBPδ、c/EBPγ、c/EBPε和c/EBPζ，且c/EBPα在脂肪细胞分化、发育过程中起着关键性作用，可以激活一些脂肪细胞分化相关基因的转录和表达(皇甫一凡,2013;盘道兴等,2017)。CCAAT增强子结合蛋白家族中c/EBPα蛋白是第一个被证明在脂肪细胞分化过程中起重要作用的蛋白(王启贵等,2006)。有研究指出c/EBPα缺陷的小鼠出生后不久便因为低血糖死亡，经检测得出脂肪组织中脂质的积累显著地降低(Wang et al.,1995)。 在激素核受体超家族成员中PPARγ最具脂肪组织特异性，对脂肪细胞的分化起着重要的作用。而在c/EBP家族中，c/EBPα可促进PPARγ的高表达，保持分化细胞的表型，在脂肪细胞的分化过程中起着关键性的作用，说明c/EBPα与PPARγ存在着相互作用(刘毅等,2008)。有研究表明，外源表达PPARγ与c/EBPα基因能将体外培养的成肌细胞转化为脂肪细胞(姜美华等,2013)。因此，PPARγ与c/EBPα基因可作为研究脂肪在猪的不同组织表达水平的候选基因。本试验通过qRT-PCR技术对PPARγ基因与c/EBPα基因m RNA在苏太猪的心、肝、脾、肺、肾等8个不同组织的表达水平进行测定分析，以探究PPARγ与c/EBPα基因在苏太猪脂肪沉积的影响，为进一步研究苏太猪脂肪沉积相关基因提供基础参考。 1 结果与分析 1.1 引物扩增产物的检测 目标基因(PPARγ,c/EBPα)和内参基因(GAPDH)通过普通PCR扩增获得。再用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测得到的扩增产物(图1)，结果可见产物特异性强，未发现有引物二聚体，且扩增片段与目的片段大小一致，可用于下一步试验。 1.2 qRT-PCR的扩增曲线和溶解曲线 从荧光定量PCR反应后得到的扩增曲线和溶解曲线可以看出(图2;图3)，基因在不同组织中扩增曲线呈现完好的“S”形状。循环阈值(CT)处于扩增曲线的对数期，大小适当，从溶解曲线可看出c/EBPα与PPARγ基因均表现为单峰，无其他非特异性扩增产物和引物二聚体，表明定量试验结果准确可靠，符合试验要求。 图1 PPARγ,c/EBPα,GAPDH凝胶电泳分析 Figure 1 Gel electrophoresis analysis of PPARγ,c/EBPαand GAPDH 注:A:PPARγ;B:c/EBPα;C:GAPDH;M:Marker 1 000 1.3 PPARγ和c/EBPα基因在苏太猪不同组织中的表达情况分析 用qRT-PCR技术对心、肝、脾、肺等8个组织中PPARγ、c/EBPα基因mRNA进行表达量水平分析，用内参基因进行均一化处理。结果显示，PPARγ基因与c/EBPα基因在8个组织中均有表达，PPARγ基因在脾脏组织中的表达量最高，背最长肌中表达量最低，不同组织中的表达量高低顺序为脾>皮下脂肪>肺>心>胃>肾>肝>背最长肌；而c/EBPα基因在8个组织中皮下脂肪的表达量最高，背最长肌为最低，其表达量的高低顺序为皮下脂肪>肝>脾>肺>肾>心>胃>背最长肌(图4;图5)。 图2 PPARγ基因扩增曲线和溶解曲线 Figure 2 Amplification and dissolution curve of PPARγgene 图3 c/EBPα基因扩增曲线和溶解曲线 Figure 3 Amplification and dissolution curve of c/EBPαgene 2 讨论 随着生活水平的提高，人们对肉的风味与品质方面也更加关注。本试验以脂肪相关基因PPARγ和c/EBPα为候选基因，探究PPARγ和c/EBPα基因在苏太猪的不同组织中表达水平。杜琛等(2016)通过PPARγ-shRNA慢病毒感染脂肪细胞后，在蛋白水平抑制PPARγ的表达，得出PPARγ基因有促进绒山羊肌内前脂肪细胞分化作用。龚兰等(2011)研究表明，PPARγ可在骨骼肌细胞上有效表达并与IMF代谢呈一定关联，PPARγ基因在猪骨骼肌细胞中有较高表达且与脂肪合成有正相关。韦璇等(2014)研究得出c/EBPα在脂尾型的羊和滩羊、肥臀型的哈萨克羊尾部脂肪组织中的mRNA表达水平较高，而在瘦尾型的陕北细毛羊、西藏羊尾部脂肪组织中表达水平相对较低，可知c/EBPα基因与脂肪的形成存在关联。武春艳等(2014)研究转录因子互作调控鸡脂肪细胞分化，发现c/EBPα基因过表达促进PPARγ基因的启动子活性。宋新磊等(2008)研究发现c/EBPα与协同PPARγ作用影响脂肪细胞的分化。陈胜锋等(2007)对原代培养大鼠脂肪前体细胞分化过程中PPARγ和c/EBPαmRNA的表达研究得出，在不同的时期PPARγ和c/EBPαmRNA的表达量不同，但到了一定时期后两者表现为协同作用，共同维持脂肪细胞增值及分化，直至脂肪细胞成熟。试验结果表明c/EBPα和PPARγ基因的相对表达量在背最长肌均为最低，在皮下脂肪中的相对表达量较高。PPARγ基因在苏太猪在脾中的表达量为最高，皮下脂肪中的表达水平仅次于脾，背最长肌与脾、肺和皮下脂肪的相对表达差异极显著(p<0.01)，其余为差异不显著(p>0.05)，表达量高低顺序为脾>皮下脂肪>肺>心>胃>肾>肝>背最长肌；c/EBPα基因在苏太猪的皮下脂肪的表达量最高，以背最长肌中c/EBPα基因的相对表达量比较，在肝、脾、皮下脂肪组织中表达差异极显著(p<0.01)，肺的相对表达差异显著(p<0.05)，其余组织中差异不显著(p>0.05)，表达量的高低顺序为皮下脂肪>肝>脾>肺>肾>心>胃>背最长肌。结果显示PPARγ和c/EBPα基因在皮下脂肪组织中都有较高的表达水平，在背最长肌中的表达均为最低，PPARγ和c/EBPα基因在苏太猪中各组织的相对表达量的趋势趋于一致，推测PPARγ和c/EBPαx基因对苏太猪的不同组织中脂肪沉积有协同作用。 图4 PPARγ基因在组织的表达差异 Figure 4 PPARγgene expression differences in the organization 注:H:心;L:肝;Sp;脾;Lu:肺;K:肾;St:胃;LID:背最长肌;SF:皮下脂肪;图中相同字母之间差异不显著(p>0.05),不同字母之间差异极显著(p<0.01) 图5 c/EBPα基因在组织的表达差异 Figure 5 c/EBPαgene expression differences in the organization 注:H:心;L:肝;Sp:脾;Lu:肺;K:肾;St:胃;LID:背最长肌;SF:皮下脂肪;图中相同字母之间差异不显著(p>0.05),相同字母,大小写不同的之间差异显著(p>0.01);不同字母之间差异极显著(p<0.01) 3 材料与方法 3.1 试验动物 试验动物选自贵州省白洗猪种质资源保护基地，选用10月龄健康无疾病的苏太猪，按照国家《生猪屠宰操作规程》(GB/T17236-1998)标准进行屠宰，采集心、肝、脾、肺、肾、胃、背最长肌和皮下脂肪8个组织样，锡箔纸包装编号后放入液氮中保存，带回实验室转入-80℃冰箱保存备用。 3.2 主要仪器 高压灭菌锅、紫外可见分光光度计、-80℃冰箱、PCR扩增仪(C1000 TouchTM)、凝胶成像系统(Universal HoodⅡ)、电泳仪、实时荧光定量PCR仪(型号为CFX96 Real-Time System)、高速冷冻离心机、电子恒温水浴锅、梯度PCR仪、制冰机、4℃冰箱、-20℃冰箱、振荡器、小型离心机。 3.3 主要试剂 Trizol、氢氧化钠、氯仿、液氮、异丙醇、75%乙醇琼脂糖、0.5%TAE、枪头、PCR管、1.5 m L离心管、5 m L与10 mL的塑胶试管、逆转录试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)等。 3.4 Trizol法提取组织总RNA 采用Trizol法提取8个组织样的总RNA，吸取1μL的RNA于超微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度(OD260/OD280=1.8～2.0)，并用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取效果，将剩余的RNA放入-80℃冰箱保存。 3.5 cDNA第一链的合成 本研究预先将RNA模板、dNTP Mix、primer Mix、RT Buffer、HiFiscript和RNase-Free Water置于冰上溶解备用，其详细反应体系如下：Control GAP-DH RNA(50 ng/μL)2μL、RiboLock RNase Inhibitor(20 U/μL)1μL、Primer Mix 1μL、5×Reaction Buffer 4μL、10 mmol/L dNTP Mix 2μL、Revert Aid RT(200 U/μL)1μL、Water(nuclease-free)9μL。将反应物于PCR仪上42℃孵育50 min,85℃孵育5 min，反应结束后，-20℃保存备用，取1μL反应产物于超微量紫外分光光度计进行浓度和纯度检测。 3.6 荧光定量PCR引物设计 从基因库中查找PPARγ、c/EBPα目的基因，以GAPDH基因作为本次试验的内参基因。用Primier5.0软件设计引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RT-PCR扩增引物的序列及其引物片段大小详细信息如下(表1)。 表1 引物信息 3.7实时荧光定量PCR条件优化及荧光定量PCR反应 采用SYBR GreenⅠ荧光染料法在荧光定量PCR仪上进行表达水平检测，运用RT-PCR摸索并优化反应条件，确定最佳反应体系。以GAPDH作为内参基因，用苏太猪的心、肝、脾、肺等8个组织的c DNA为模板进行PPARγ与c/EBPα基因的荧光定量PCR扩增，反应条件为：95℃预变性10 min;95℃变性13 s;59℃退火30 s;72℃延伸32 s；进行循环40次后进行溶解曲线分析：95℃15 s,60℃15 s，然后以每10 s上升0.5℃的速率从60℃升到95℃。每个组织样品的每个基因要求3个平行重复，荧光采集时间为5 s。 3.8实验数据的处理分析及分析方法 本次试验数据应用2-△△Ct法分析PPARγ与c/EBPα基因在苏太猪心、肝、脾、肺、肾、胃、背最长肌和皮下脂肪8个不同组织中的差异表达量，测得的试验数据用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。 参考文献 [1]Adams M.,Montague C.T.,Prins J.B.,Holder J.C.,Smith S.A.,Sanders L.,Digby J,E.,Sewter C.P.,Lazar M.A.,Chatterjee V.K.,and 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