14次 摘要：目的 原核表达三元融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-(简称MSIK),并在细胞和小鼠水平上对其抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的功能进行研究。方法 构建三元融合蛋白MSIK的原核表达质粒pET30-MBP-SERPINA3-IFN-,将构建好的质粒转入BL21(DE3)codon Plus --> 摘要：目的 原核表达三元融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ(简称MSIK),并在细胞和小鼠水平上对其抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的功能进行研究。方法 构建三元融合蛋白MSIK的原核表达质粒pET30-MBP-SERPINA3-IFN-κ,将构建好的质粒转入BL21(DE3)codon Plus大肠埃希菌并利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactophyranoside,IPTG)诱导蛋白的表达,经亲和层析纯化得到蛋白,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证目的蛋白的纯度,用1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)分别在角质细胞中及BALB/c小鼠上验证该蛋白的抗病毒活性,通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测样本中病毒的含量。结果 该融合蛋白经IPTG诱导表达并由亲和层析纯化后,获得相对分子质量约为100×103的纯化蛋白,经SDS-PAGE法检验,并使用Image J进行灰度分析,该融合蛋白纯度大于95%。在角质细胞中,该三元融合蛋白能够有效抑制HSV-1病毒的复制,在小鼠皮肤创伤模型中,该三元融合蛋白同样能够有效抑制HSV-1病毒的复制并能够促进创口的愈合。结论 成功表达了三元融合蛋白MSIK,并利用亲和层析柱进行了有效的纯化。获得的融合蛋白具有良好的生物学活性,能够有效抑制HSV-1病毒的复制并促进创口的愈合。该三元融合蛋白可用于研发有效的抗HPV护创敷料,用来治疗一些由HPV引发的相关疾病。 关键词：融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ; 原核表达; 亲和层析; 人乳头瘤病毒; 1型单纯疱疹病毒; 促创口愈合; 人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)属于乳头多瘤空泡病毒科乳头瘤病毒属,为一组无包膜的小分子双链环状DNA病毒,人的皮肤和黏膜上皮细胞为其主要宿主细胞[1]。根据HPV的生物学特征和致癌潜能,可将其分为低危型和高危型[2-4]。其中低危型主要引起感染部位的低度病变、生殖器或皮肤疣和尖锐湿疣,而高危型HPV的持续感染与宫颈癌的发生密切相关[1,5]。 目前虽有较多的治疗HPV感染的方法,但普遍使用传统的治疗手段[6]:如手术、激光、外涂药物等,其目的都只是去掉临床肉眼可见的疣体,却难以解决亚临床以及潜伏感染的问题,治标不治本,致使反复发作[7-8]。另外,虽然目前已经能够通过接种HPV疫苗来预防HPV感染[9],但其成本很高,极大地限制了大范围的推广[5]。因此,目前由HPV感染引发的相关疾病的治疗依然十分重要和严峻。 迄今为止,世界上治疗HPV的抗病毒药物极为匮乏。其中山西锦波生物医药股份有限公司开发的生物蛋白敷料(JB01-BD)被临床试验证明安全有效,也为宫颈癌的防治做出了一定的贡献[10]。其活性蛋白质的作用机制,是针对HPV病毒的侵染和复制过程。但是,由于HPV在体内的复制效率很低,活体组织上很难检测到活的HPV病毒。HPV感染所引起的宫颈癌和其他病症往往并不是由HPV的直接感染造成,而是由于HPV致癌基因的整合,以及HPV慢性感染和长期低剂量复制对宿主的影响而引起,所以直接针对HPV活跃病毒的复制而进行抑制难于有好的效果[2]。 HPV感染后难以清除[11],一是由于子宫颈上皮细胞本身容易受到损伤,产生微创,给病毒传播产生了通道;二是由于子宫颈上皮细胞的局部免疫系统不活跃,容易给病毒有可乘之机。 本研究针对这些问题,设计了一种三元融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ(简称MSIK)。其中,SERPINA3是一种近期发现的胰凝乳蛋白酶抑制剂,外敷时可以帮助上皮细胞的微小创口愈合,促进局部皮肤再生[12]。IFN-κ是新近发现的一种上皮细胞特异的Ⅰ型干扰素,激活上皮细胞的抗病毒免疫,抑制病毒复制[13]。MBP(麦芽糖结合蛋白)可以增加融合蛋白的可溶性及稳定性。经验证,该融合蛋白同时具有SERPINA3 和IFN-κ的生物学活性及功能,这些特性为其成为一种抗HPV的生物蛋白敷料提供了潜在的可能。 1 材料与方法 1.1 菌株及载体 原核重组载体pET30(经本实验室改造带有MBP标签),大肠埃希菌(Escherichia coli)株系DH5α和BL21(DE3) codon Plus均为本实验室保存。 1.2 主要试剂及仪器 金牌MixDNA聚合酶购自擎科生物,限制性内切酶 Ssp Ⅰ、 Kpn Ⅰ、 Bamh Ⅰ 购自 Thermo Scientific公司(美国),重组酶购自南京Vazyme公司,蛋白Marker及DNA Marker购自Takara公司(日本),DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自Axygen公司(美国),PCR引物合成及重组质粒测序由金唯智公司完成,琼脂糖、琼脂粉购自生工生物,LB培养基购自BD公司(美国),水合氯醛购自生工生物,DMEM细胞培养基、FBS购自Hyclone公司(美国),移液管、培养皿、孔板等细胞实验耗材购自耐思生物,TRIzol RNA 提取试剂购自Invitrogen公司(美国),RT Master Mix逆转录试剂盒购自Abm公司(加拿大),SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自Takara公司(日本),CO2恒温培养箱购自上海Heal Force公司。mastercycler ep realplex2荧光定量PCR仪购自Eppendorf公司(德国)。Avanti JXN-26落地低温超速离心机购自贝克曼库尔特公司(美国)。 1.3 细胞及小鼠 BALB/c小鼠:南开大学实验动物中心提供[许可证号:SYXK(津)2014-00003],角质细胞由暨南大学宾亮华实验室惠赠。HSV-1病毒由南开大学曹又佳实验室惠赠。 1.4 重组质粒的构建与鉴定 使用Overlap PCR方法以GGSGG为linker将SerpinA3基因和 IFN-κ 基因拼接到一起。PCR过程中使用到的4条引物分别为,引物1:SERPINA3-F:5′-TACTTCCAATCCAATGCCCACCCTAACAGCCCA-3′,引物2:SERPINA3-R:5′-CCCTCCACTGCCACCGGCTTGCTTGGGATT-3′,引物3:IFN-κ-F:5′-GGTGGCAGTGGAGGGCTGGACTGTAACTTA-3′,引物4:IFN-κ-R:5′-TTATCCACTTCCAA-TGCTATTATTTCCTCCTGAA-3′。使用SspⅠ 酶切处理pET30载体质粒,PCR产物和酶切载体经重组酶处理后转化至DH5α。挑取单菌落并进行质粒提取,由金唯智公司进行测序鉴定。将测序正确的质粒命名为pET30-MBP-SERPINA3-IFN-κ。 1.5 重组质粒蛋白的诱导表达 将测序正确的质粒转化到BL21(DE3)codon Plus大肠埃希菌感受态细胞中。挑取单菌落于100 ml LB(Kana抗性)液体培养基中,37 ℃,220 r/min恒温振荡培养 6～8 h至吸光度A600=0.6～0.8,以每份20～30 ml的量分装到1 000 ml LB(Kana抗性)液体培养基中,37 ℃,220 r/min恒温振荡培养3～5 h至吸光度A600=0.6～0.8。每瓶加入100 μl浓度为1 mol/L 的IPTG诱导蛋白的表达,16 ℃,220 r/min恒温振荡培养12～16 h,4 000 r/min离心20 min收集菌体,以30 ml Binding Buffer(20 mmol/L Tris,0.5 mol/L NaCl)重悬菌体,置于-30 ℃保存备用。 1.6 融合蛋白的亲和纯化及鉴定 菌体解冻后进行超声破碎,以4 ℃、18 000 r/min离心40 min。收取上清加至由Binding Buffer平衡的含有MBP亲和beads的重力柱中,重复 3 次以增加结合效率。用10 ml的Binding Buffer洗涤柱子,重复 3 次从而去除杂蛋白,用MBP Elute Buffer(20 mmol/L Tris,0.5 mol/L NaCl,10 mmol/L麦芽糖)洗脱目的蛋白并收集洗脱组分,进行冷冻干燥处理后存于-80 ℃。最后,用质量分数为12%的SDS-PAGE胶结合考马斯亮蓝染色法分析目的蛋白的纯度以及可能的降解情况。 1.7 RNA的提取、反转录及Q-PCR检测 细胞样品直接使用Trizol法提取总RNA,皮肤样品经液氮冷冻研磨后使用Trizol法提取总RNA。提取的总RNA立刻进行反转录合成cDNA,反转录体系为:RNA 2 μg、RT Master Mix 4 μl、补RNase Free dH2O至20 μl。反应条件为:25 ℃ 10 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。反转录的cDNA进行Q-PCR检测,反应体系为:SYBR green MIX 10 μl、 引物8 μl、cDNA 2 μl。 反应条件为:95 ℃ 2 min预变性、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,共40个循环,在每个循环结束时进行荧光信号检测。 1.8 融合蛋白在角质细胞中对HSV-1的影响 接种适量角质细胞至六孔板,在37 ℃,5%CO2的恒温培养箱中培养18～24 h,至细胞融合度到达70%左右。用不同浓度的MSIK蛋白处理2 h并以PBS处理作为对照,随后使用HSV-1感染24 h,收取1×106个细胞用Trizol法提取总RNA。对总RNA进行反转录并使用实时荧光定量PCR检测病毒拷贝。 1.9 小鼠皮肤创口愈合实验及融合蛋白对皮肤创口中HSV-1的影响 1.9.1 小鼠皮肤创口的形成 取BALB/c雄性小鼠,使用剃须刀除净背部毛发,用质量分数为4%的水合氯醛麻醉小鼠,体积分数为75%的乙醇棉球擦拭皮肤进行消毒,用直径6 mm打孔器在小鼠背部制造皮肤创口。 1.9.2 融合蛋白对皮肤创口愈合的影响 每组 5 只 BALB/c雄性小鼠,在其背部制造创口,在创口处分别滴加10 μl浓度为50 μg/ml和100 μg/ml的融合蛋白溶液,以PBS溶液处理作为对照。每天重复进行上述处理,观察创口愈合情况并进行创口大小的测量及统计,同时对创口进行拍照。 1.9.3 融合蛋白对皮肤创口中HSV-1的影响 每组3只BALB/c雄性小鼠,在其背部制造创口。在创口处滴加10 μl不同浓度的融合蛋白溶液并以PBS溶液处理作为对照,18 h后在创口处滴加滴度为1×109/ml的HSV-1病毒10 μl进行感染,随后3 d重复进行上述处理。在第3 天,使用断颈法处死小鼠,取小鼠创口以及周围2 mm处的皮肤并在液氮中速冻。在研钵中快速将皮肤研磨成粉末(期间不断使用液氮降温防止RNA降解)。研磨后的皮肤使用Trizol法提取总RNA,将总RNA进行反转录并使用实时荧光定量PCR检测病毒拷贝数。 2 结 果 2.1 三元融合蛋白MSIK的表达纯化及鉴定 重组原核表达质粒pET30-MBP-SERPINA3-IFN-κ转化到BL21(DE3)codon Plus大肠埃希菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactophyranoside,IPTG)诱导后蛋白可以高效地进行表达。由MBP柱亲和层析后可以获得目的蛋白。经质量分数为12%的SDS-PAGE检测,结果如图1所示,破碎后的大肠埃希菌上清液中含有大量的目的蛋白,洗脱液样品在相对分子质量约100×103 处可见清晰的目的蛋白的条带,并且洗脱液样品中无明显可见的杂带。经过浓度测定可知,1 L 大肠埃希菌可纯化出5 mg左右的融合蛋白。 2.2 在角质细胞中融合蛋白MSIK有抑制HSV-1作用 由于HPV在体外很难培养,故本课题组使用跟HPV生活周期相近的HSV-1来进行代替。将角质细胞用不同浓度的MSIK蛋白处理2 h,随后使用HSV-1感染24 h,由Q-PCR检测各组细胞内病毒拷贝。结果如图2所示,角质细胞经融合蛋白MSIK处理后,细胞内HSV-1的含量显著降低,并且随着蛋白浓度的提高,其对HSV-1的抑制作用愈强。说明该三元融合蛋白MSIK在角质细胞中对HSV-1具有显著的抑制作用。 图1 纯化蛋白的SDS-PAGE分析结果 注:1为大肠埃希菌破碎离心后的上清液;2为流穿液;3为Binding Buffer洗脱液;M为蛋白分子量Marker;4为MBP Elute Buffer洗脱液。 图2 MSIK蛋白对角质细胞内HSV-1增殖的影响 注:将角质细胞用不同浓度MSIK蛋白处理2 h后,HSV-1刺激24 h,使用Q-PCR检测各组细胞内病毒拷贝。实验结果来自3次独立重复实验,以平均值和标准差表示。数据统计采用双尾t检验(aP<0.01,bP<0.001)。 2.3 融合蛋白MSIK能够促进小鼠创口的愈合 分别以质量浓度为50 μg/ml和100 μg/ml的融合蛋白MSIK处理小鼠创口,以PBS溶液处理作为对照。每天重复进行上述处理,进行创口大小的测量及统计,并拍照。结果如图3和图4所示,融合蛋白MSIK能够有效地加速小鼠创口的愈合,并且具有十分显著的效果。对小鼠创口直径进行统计和分析,结果显示该融合蛋白的促创口愈合功能随蛋白浓度的升高而加强,并且差异有统计学意义(P=0.03),稳定可信。 图3 小鼠创口愈合图 注:使用100 μg/ml MSIK蛋白处理创口,并以PBS处理为对照组。 图4 小鼠创口直径统计结果 注:每组5只小鼠,以不同浓度MSIK蛋白处理创口,实验结果来自3次独立重复实验,以平均值和标准差表示。数据统计采用双尾t检验(aP<0.05)。 2.4 融合蛋白MSIK对小鼠创口内的HSV-1具有抑制作用 使用不同浓度融合蛋白MSIK处理小鼠创口,18 h后用HSV-1病毒感染创口,连续处理3 d后,以Q-PCR检测创口HSV-1的含量。结果如图5所示,该融合蛋白能够有效抑制皮肤创口内HSV-1的增殖,并且该融合蛋白对HSV-1病毒的抑制能力与其浓度呈正相关。实验经3次重复,数据经分析差异有统计学意义(P=0.007)。 图5 小鼠创口内HSV-1含量的检测 注:使用不同浓度融合蛋白MSIK处理小鼠创口,随后用HSV-1病毒感染创口,并以Q-PCR检测创口HSV-1的含量。实验结果来自3次独立重复实验,以平均值和标准差表示。数据统计采用双尾t检验(aP<0.05, bP<0.01)。 3 讨 论 HPV需要通过子宫颈鳞状上皮细胞的微创口进入,才能在人体内完成感染。这些微创口很容易产生(如性交、上皮细胞死亡脱落、细菌感染等),一般不会流血和引起可见的炎症而引人注意。自身的皮肤修复系统对这些微创口的修复非常缓慢。另外,子宫颈上皮细胞的局部免疫系统不活跃,很难对HPV的感染产生有效的免疫反应。所以,对于HPV感染的治疗,在促进微创口愈合的同时,有效激活子宫颈上皮细胞的局部免疫系统,就显得至关重要。 本研究设计的融合蛋白中,SERPINA3可以有效加快微创口的修复[12],使子宫颈鳞状上皮细胞层形成完整的屏障,阻断HPV的感染。IFN-κ可以有效激活局部的上皮细胞抗病毒免疫信号通路,抑制和杀灭HPV[13]。对比IFN-α或IFN-β,IFN-κ限定在上皮细胞表达,通过自分泌途径激活,所以只在上皮细胞局部起作用,外敷时不进入血液循环,不会引起全身性反应,从而避免长期使用IFN-α和IFN-β时的不良反应。另外,近期的研究发现,IFN-κ与HPV感染紧密相关,HPV感染抑制IFN-κ的表达,而外源表达的IFN-κ可以抑制HPV的激活,IFN-α和IFN-β并不具备上述特征[14]。这2种活性蛋白的联合使用,会有效解决HPV不易清除的难题。 由于IFN-κ具有很强的疏水性[15],因此,其单独在原核表达系统中表达,基本以包涵体的形式存在。虽然包涵体经过变性复性也可以得到部分可溶的蛋白,但其操作复杂并且这些纯化方式不利于后期的应用。本研究设计的三元融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ(MSIK)中,MBP(麦芽糖结合蛋白)可以极大地增加IFN-κ的可溶性与稳定性,还可以通过与细胞表面糖链的结合协助融合蛋白附着于细胞表面。SERPINA3本身的溶解性及稳定性均较好,也为整个融合蛋白的溶解及稳定提供了一定的帮助。本课题组获得的融合蛋白具有良好的溶解性和稳定性,并且可以通过简单的亲和层析的方法得到大量的高纯度蛋白,这些特性为其以后的应用提供了极大的帮助。 此外,本实验结果显示,三元融合蛋白MSIK具有良好的生物学活性,在细胞和小鼠个体水平均可有效抑制HSV-1的复制(由于HPV在体外很难培养,所以我们使用跟HPV生活周期相近的HSV-1来进行代替)。与此同时,在小鼠创口恢复过程中,该蛋白也能有效促进小鼠创口的愈合。 综上所述,本研究设计的三元融合蛋白MSIK均一性好,易于纯化,活性高,无不良反应,非常适合作为抗HPV的宫颈护创敷料,具有较为广泛的应用前景。 参考文献 [1] Ding YZ,Wen JY,Lai BL,et al.Caffeic acid has activity against the human papillomavirus[J].Bingdu Xuebao,2018,34(3):287-295.(in Chinese)丁永桢,温嘉泳,赖宝龙,等.咖啡酸抗人乳头瘤病毒感染的研究[J].病毒学报,2018,34(3):287-295. 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